Подробности жизни подвижника известны нам из Жития преподобного Дионисия. Его автор, троицкий келарь Симон (Азарьин), называл святого Дорофея «великим трудником» и даже посвятил ему отдельную главу «О Дорофее иноке и о крепком житии его», которая основана на рассказах архимандрита Дионисия и священника Иоанна Наседки.

Преподобный Дорофей нес полушание канонарха Троицкого собора, пономаря в церкви преподобного Никона и библиотекаря. Кроме того, настоятель поручил ему навещать больных и раненых людей, пострадавших во время осады монастыря поляками, и раздавать им деньги и вещи. Он не только безукоризненно исполнял возложенные на него послушания, но и добровольно брал на себя еще большие труды. Целые ночи он проводил в беседах с больными и увечными, стараясь поддержать их и утешить. Кроме общего правила, которое он совершал вместе с архимандритом, отец Дорофей ежедневно прочитывал всю Псалтирь и полагал тысячу поклонов. Спал он очень мало и никогда не ложился. Сидя за рукоделием, лишь слегка предавался дремоте. Пищей ему служили небольшой кусочек хлеба или ложка толокна с водой. По три - четыре дня, а то и больше совсем ничего не ел и не пил. Ухаживая за больными, он не смывал грязь и гной с рук и одежды. Лицо и ладони умывал слезами. Ноги его опухли от долгого стояния при исполнении данных ему послушаний. Стремясь уберечь отца Дорофея от преждевременной смерти, авва Дионисий едва уговорил его питаться хлебом с квасом.

«Он был так тверд в благочестии, - пишет Симон (Азарьин), - что никогда не оставлял церковного богослужения, исправлял должность пономаря в церкви чудотворца Никона и вместе с тем был канонархистом и книгохранителем. В келлии он выполнял правило необыкновенное: ежедневно читал всю Псалтирь и клал до тысячи поклонов; притом же писал книги». 

По словам Иоанна Наседки, «болезнь ему была от поста презелново и от жажды великия; и ноги его опухли от стояния, от службы вверенныя ему». За несение большого количества послушаний и строгость поста он нередко подвергался укорам и даже насмешкам от некоторых из братий, которые смиренно переносил. 

Одним из многих послушаний преподобного Дорофея было переписывание книг. Некоторые экземпляры, написанные его рукой, до сих пор хранятся в лаврской библиотеке. 

В самый разгар Смуты архимандритом Троицкого монастыря стал преподобный Дионисий (Зобниновский). По его распоряжению часть монастырской казны была использована на строительство домов призрения в Служней слободе и в Клементьеве. Ближайшим помощником архимандрита в попечении о страждущих стал преподобный Дорофей. По благословению преподобного Дионисия он разносил деньги и одежду больным и раненым, «всегда нощию все з болными, и с нагими, и с увечными беседуя, и архимандриту все о всех возвещая, и всем бедным и немощным вся полезная и добрая творяше» (Житие. С. 394). 

Поучительна беседа преподобного Дорофея с архимандритом Дионисием незадолго до смерти подвижника. 

Как-то архимандрит Дионисий собирался в Москву. Братия подошла к нему за благословением, вышел и Дорофей, прося себе последнего прощения. 

— Уже время мое приходит, — говорил он, — и смерть приближается; о едином скорблю, что уезжаешь отсюда и не сподоблюсь погребения от твоей преподобной руки. 

Дионисий как бы в шутку сказал ему: 

— До моего приезда будь жив и не дерзай умирать, доколе не возвращусь от самодержца; тогда умрешь, если Господь изволит, и я погребу тебя. 

— Воля Господня да будет, — отвечал Дорофей. 

Когда архимандрит вернулся, к нему вновь подошел Дорофей. Преподобный благословил его, простился с ним, а сам, облачившись, пошел в церковь петь молебен за царское здравие, по традиции Троицкой обители. Но не успел он начать молебен, как ему сообщили, что его келейник отошел ко Господу. Подвижник был погребен в Троице-Сергиевом монастыре преподобным Дионисием «со всем собором». 

Точная дата кончины преподобного Дорофея неизвестна. Иоанн Наседка пишет о себе, что «после разорения московскаго вскоре прибрел к дому Пресвятыя Троицы и того старца Дорофея за полтора года до смерти его застал». Годом разорения Москвы Иоанн называет 7118 год. Следовательно, подвижник скончался примерно в 1613 году. 

О раннем почитании отца Дорофея свидетельствует включение его имени в месяцеслов келаря Симона Азарьина, составленный в Троице-Сергиевом монастыре около середины 50-х гг. XVII века, где Дорофей назван преподобным. А это значит, что местное почитание святого началось уже вскоре после его смерти. Канонизация преподобного Дорофея подтверждена включением его имени в Собор Радонежских святых (празднование установлено в 1981 году). «Великим трудником» Дорофей именуется в «Описании о российских святых».